AmBeed文献解读|Cell

改造 IscB 和 Cas9 为 RNA 引导的 RNA 编辑器

2025年8月18日，耶鲁大学Ailong Ke教授领衔的研究团队在《Cell》上发表了一篇题为《Conversion of IscB and Cas9 into RNA-guided RNA editors》的研究论文。这篇文章的核心内容是关于一种新型RNA编辑工具—R-IscB的开发和应用。R-IscB是通过改造IscB蛋白，将其从一种DNA靶向的核酸酶转变为一种RNA靶向的编辑工具。这种改造是通过删除IscB的靶标邻近基序(TAM)相互作用域(TID)来实现的。这一发现不仅为RNA编辑领域提供了新的工具，还为开发更高效、低细胞毒性的RNA编辑技术提供了重要的理论依据。

要点速览

l 移除或破坏TID结构域可将IscB转化为RNA编辑器。

l R-IscB的活性与Cas13相当,但没有明显的细胞毒性。

l R-IscB在剪接干扰、A-to-I编辑和转拼接方面表现出色。

l 同样的方法可将几种Cas9转化为高效的RNA编辑器。

AmBeed产品在本文中的应用

在本文中，生物素(Biotin, A122167)产品被用于蛋白质纯化的洗脱步骤中，使用50mM生物素从Strep-Tactin XT树脂中洗脱IscB蛋白。这是因为Strep-Tactin XT树脂上的链霉亲和素(Streptavidin)对生物素具有极高的亲和力，生物素可以有效地将与链霉亲和素结合的IscB蛋白洗脱下来。

实验结果

1. TID结构域是决定IscBDNA靶向偏好性的关键

图 1. 野生型 IscB 能结合单链 RNA 和单链 DNA，但强烈偏好双链 DNA

野生型IscB能够通过其导向RNA高亲和力地结合互补的单链DNA(ssDNA)和单链RNA(ssRNA),但竞争实验揭示其强烈偏好双链 DNA(dsDNA)—即dsDNA能轻易竞争掉已结合的ssRNA,而ssRNA却无法干扰其对dsDNA的切割。

基于这些现象，研究者提出了一个核心假设：TID结构域是造成这种功能偏好的关键。它像一个“锚”，通过持续地扫描和结合dsDNA上的TAM序列,将IscB牢牢地“锁定”在DNA靶向模式上,从而抑制了其本底的单链核酸(尤其是RNA)结合与编辑功能的发挥。

2. 删除TID域成功将IscB转变为专一RNA编辑器R-IscB

图2. TID去除破坏了dsDNA结合，但不影响ssRNA和ssDNA结合

基于“解除TID域对IscB的DNA锁定”这一假设，研究团队通过删除TID结构域成功将其改造为专一的RNA编辑器R-IscB，该变体完全丧失了DNA结合能力，同时保留了对靶标RNA的超高亲和力与“种子序列”识别机制，使其在靶标搜索效率上可能优于Cas13。

3. R-IscB被验证为高效的多功能RNA编辑平台

图 3. R-IscB 通过 RNA 导向的方式实现强效剪接干扰

研究团队在人类细胞中验证了R-IscB作为一种多功能RNA编辑平台的巨大潜力。通过靶向关键基因的剪接位点，R-IscB能够高效调控pre-mRNA的剪接过程，从而在治疗显性负效应遗传病(通过基因敲降)和隐性遗传病(通过阅读框校正)方面展现出应用前景。具体而言，在PKM基因中，R-IscB成功将促癌的PKM2亚型表达下调约3倍，而几乎不影响正常的PKM1亚型;在杜氏肌营养不良(DMD)模型中,它能高效介导外显子51跳跃,实现对突变mRNA高达8倍的敲降效果,为功能性蛋白的恢复提供了可能。

图 4. R-IscB 通过转剪接或 A 到 I 编辑实现高效的 RNA 序列修正

研究团队充分展示了R-IscB平台强大的多功能性：它不仅能通过反式剪接在mRNA水平上进行大片段基因校正(在报告系统中效率高达40.9%),还能在融合ADAR2dd后作为可编程的A-to-I碱基编辑器，高效修复点突变(效率达71.1%);更通过对HNH结构域的理性设计(如VR4突变体)为其赋予了直接切割RNA的能力,实现了对PCSK9、EZH2等疾病相关基因的高效敲降(mRNA残留可低至13.7%和3.4%),从而全面覆盖了从基因敲降到序列校正的多种RNA治疗需求。

4. 相较于Cas13，R-IscB展现出性能与安全性的双重优势

图 5. 结构导向工程使得 R-IscB 能够进行 ssRNA 的切割，并提高了敲除效率

在与主流RNA编辑工具PspCas13b和RfxCas13d的直接比较中,R-IscB展现出全方位的领先优势:其不仅在剪接调控和mRNA敲降效率上持平或显著超越对手(如在NF2基因敲降上领先60倍),更关键的是,它完全规避了Cas13固有的细胞毒性问题——转染Cas13的细胞出现严重生长停滞和形态异常,而R-IscB处理组则与正常细胞无异,这一卓越的安全性特征为其未来的治疗应用扫除了重大障碍。

5. 策略普适性：成功将多种Cas9改造为RNA靶向工具R-Cas9

图 6. PID 的去除使 NmeCas9 在人类细胞中转变为一种高效的 RNA 靶向工具

研究团队成功将应用于IscB的“功能域删除”理念延伸至Cas9家族,通过删除NmeCas9、SaCas9、CjCas9及Cas9d等多种同源蛋白的PAM识别域(PID),成功将它们转化为专一的RNA靶向工具(统称为R-Cas9),并在人类细胞中验证了其介导高效基因敲降的能力，充分证明了该工程化方法可广泛适用于不同的RNA引导DNA核酸酶。

研究意义

R-IscB作为一种新型的RNA编辑工具,具有高活性、低细胞毒性,并且可以通过多种机制(如剪接干扰、mRNA敲低、A-to-I编辑和转录剪接)来实现RNA编辑。R-IscB的发现为治疗遗传疾病提供了新的可能性,特别是在纠正mRNA水平上的突变方面具有潜在的应用价值。此外,这项研究还展示了通过结构指导的蛋白质工程来开发新的基因编辑工具的可能性,为未来的基因治疗提供了新的方向。

DOI: 10.1016/j.cell.2025.07.032